木质素作为世界上含量最丰富的天然多酚大分子，具有优良的抗菌、抗氧化、防紫外线、生物降解、可再生等性能，广泛应用于农业、生物医药、食品包装、化妆品、智能材料等领域。值得注意的是，纳米尺度的木质素相比相同质量的大尺寸木质素具有更显著的机械性能和生物活性。同时，木质素含有多种荧光团，也是一种发光材料。但由于共轭度低，化学结构复杂，其荧光团结构和荧光性质尚不清楚，极大地限制了其增值和大规模应用。
近日，江南大学马丕明教授、杨伟军副研究员等人以乙二胺和不同含量的维生素B为原料，通过简单的水热法制备了木质素纳米颗粒接枝维生素B杂化纳米颗粒(LEVs)。通过化学结构、荧光性质和生物活性的表征，评价了乙二胺和维生素B1对LEVs性质的影响。随着维生素B1用量的增加，合成的LEV颗粒的荧光性能得到改善。自由基清除率(RSA，%)达97.8%，抗菌率达99.9%。LEV的抑菌作用涉及多种联合机制，LEV的亚胺、酰胺基团和带正电荷的VB1的引入使其更容易与带负电荷的细菌磷脂膜相互作用，导致细菌裂解和死亡。最后通过冻融法制备了PVA/LEV水凝胶复合材料，PVA/LEV水凝胶具有更好的力学性能和抗氧化、抗菌活性等更全面的性能，具有作为高效生物医用材料的巨大潜力。
相关工作以“Preparation of Vitamin-g-Lignin Nanohybrids with Excellent Biological Activity and Fluorescence Performance”为题发表于《Biomacromolecules》。
如方案1a所示，将0.1 g 木质素纳米颗粒（LNP）溶解于10ml乙醇中，将0.1或0.2 g维生素B1分散于5ml乙醇中，将两种溶液混合并超声10min，并加入EDA 溶液（75%，5ml）分散均匀，置于水热反应器中。90℃反应1 h，得到改性颗粒分散体。将分散的溶液离心，离心后的溶液在水中透析3天，去除未反应的物质。透析液经旋蒸、冷冻干燥，得到粉末状固体。采用维生素B1 (0.1 g和0.2 g)获得的杂化纳米颗粒分别命名为LEV1和LEV2。
称取9 g PVA和51 mL去离子水，在90℃下搅拌12小时，完全溶解。随后将10毫升1 wt %的LEV分散体加入完全溶解的PVA溶液中，并将混合物倒入铝盒模具中。将混合物在- 15°C下完全冷冻12 h，然后在25°C下解冻12 h。重复两个循环以获得PVA/LEV复合水凝胶(方案1b)。
方案1. (a)水热法制备LEVs;(b)冻融法制备PVA/LEV复合水凝胶。
采用FT-IR表征了LEV的结构，如图1所示，1380和1155 cm-1处的特征峰归属于属于伯胺和仲胺或维生素B1的噻唑环的的C-N伸缩振动，1560 cm-1处的特征峰可能是维生素B1或亚胺衍生物的C = N拉伸振动。进一步通过1H NMR对LNP和LEV的结构进行了表征，如图2所示。LEV除含具LNP的基本信号峰，1.8和3.38 ppm处的信号峰可能属于维生素B1上的甲基，5.1 ppm处的信号峰属于EDA的伯胺基团，8.0 ppm处的信号峰可能属于维生素B1-C = N -结构上的氢或接枝过程中产生的酰胺基团上的氢，表明LEV的成功合成。
图1.LNP、VB1、LEV1、LEV2的FT-IR光谱。
图2.LNP、LEV1、LEV2和VB1在不同化学位移下的1H NMR谱。
对颗粒溶液进行TEM表征，观察到三种纳米级颗粒，LNP的平均粒径为20.5 ~ 60.2 nm，而LEV1和LEV2的平均粒径分别为14.5 ~ 42.1 nm和16.7 ~ 35.5 nm。与LNP相比，随着VB1添加量的增加，其粒径减小，在溶剂中的分散度增加。用荧光分光光度计对维生素B1、LNP和LEV的荧光强度进行了表征，如图3所示。与LNP相比，维生素B1没有荧光，EDA和维生素B1修饰的LEV的荧光强度显著增强。在紫外灯照射下，LNP发出微弱的绿色荧光，而LEV1和LEV2发出的荧光更为明显。此外，LEV和LNP均表现出激发波长依赖性，即随着激发波长的逐渐增加，发射波长发生红移，荧光发射强度先增大后减小。
木质素结构上的发色团(如苯基香豆素和苯乙烯)赋予木质素微弱的荧光性质。LEVs荧光性能增强归因于表面钝化和杂原子掺杂。EDA的酰胺基团可以作为LNP的钝化剂，抑制LNP的非辐射重组，实现更有效的辐射重组，提高LNP的荧光性能。此外，EDA与N、S原子在维生素B1上共掺杂，导致碳原子的核sp3杂电子轨道区和表面sp2杂电子轨道发生变化，从而引起LEV能带结构的变化。
图3. (a) LNP、(b) LEV1、(c) LEV2的TEM图像、粒径、荧光光谱和CIE图。
/ LEV的抗氧化性能 /
从图4可以看出，LEV和LNP的抗氧化活性都随着时间的推移而增加。LNP具有一定的抗氧化活性，24 h自由基清除率为77.8%。水热改性后的LEV1和LEV2在24 h时的RSA-A值分别达到93.8%和97.8%，这归因于因为木质素的抗氧化能力主要来源于分子结构上的酚羟基，酚羟基产生的苯氧自由基和H+可以作为氢供体，与•O2 -和•OH -自由基反应，从而抑制脂质过氧化作用，保护细胞免受氧化损伤。由于纳米材料的小尺寸效应、表面效应和界面效应的结合，纳米木质素具有较高的抗氧化活性。
图4.LNP、VB1、LEV1、LEV2的抗氧化活性。
采用菌落形成计数法检测LNP和LEV对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性。从图5中可以直观地看出LNP具有一定的抗菌活性，经水热改性得到的LEV对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性明显强于未改性的LNP。其中，LEV2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率提高到99.9%。LEV的抑菌作用涉及多种联合机制，LEV的亚胺、酰胺基团和带正电荷的VB1的引入使其更容易与带负电荷的细菌磷脂膜相互作用，导致细菌裂解和死亡。
图5. LNP, VB1, LEV1, 与LEV2.的抗菌性能。
作者选择LEV2和PVA，采用冻融法制备了PVA/LEV2复合水凝胶。力学性能测试表明（图6），LEV2的加入增强了水凝胶的压缩模量和拉伸模量，压缩模量从51.2 KPa增加到182.1 KPa，拉伸模量和强度分别从60和90 KPa增加到90和140 KPa。这可能是由于LEV2与PVA基体在界面处存在较强的氢键相互作用。LEV2的刚性芳香结构、三维网络结构和纳米相分离结构使复合水凝胶的力学性能得到改善。此外，PVA/LEV2复合水凝胶的粘附强度为3.25±0.15 Kpa，可作为伤口敷料使用。
图6. PVA和PVA/LEV2复合水凝胶的力学性能。
/ PVA/LEV2复合水凝胶的抗氧化与抗菌性能/
从图8可以看出，相比PVA水凝胶，PVA/LEV2具有明显的抗氧化活性，且PVA/LEV2水凝胶的自由基清除率随着时间的增加而增加， 24 h的RSA值可达到50%。PVA/LEV2水凝胶的抗氧化活性主要归因于LEV的抗氧化活性。从图9可以看出，纯PVA水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性很小。而PVA/LEV2复合水凝胶的抑菌活性较好，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率均达到99.0%。
图7. 不同时刻PVA和PVA/LEV2的抗氧化活性。
图8. f PBS, PVA, and PVA/LEV2的抗菌性能。
在本工作中，作者作采用简单的水热法，利用EDA和维生素B1修饰木质素纳米颗粒(LNP)，得到LEV。木质素的羧基和羰基活性位点与EDA和维生素B1的氨基之间的反应引入了亚胺、季铵离子和酰胺结构，使得LEV更容易与带负电的细菌磷脂膜相互作用，导致细菌溶解和死亡。同时，由于给电子基团的存在，LEV的生物活性和荧光性能也同步提高。在此基础上，采用简单的冻融法制备了PVA/LEV复合水凝胶。LEV的加入增强了水凝胶的压缩模量和拉伸模量，压缩模量从51.2 KPa增加到182.1 KPa，拉伸模量和强度分别从60 KPa和90 KPa增加到90 KPa和140 KPa。PVA/LEV水凝胶具有较好的抗氧化和抗菌性能，可作为伤口敷料使用。
https://doi.org/10.1021/acs.biomac.4c00681
